Что такое система протеина С: определение активности. Протеин С – показатели нормы, причины отклонения от нормы Определение активности системы протеина с при беременности

Д.Х. ХИЗРОЕВА, И.А. МИХАЙЛИДИ, Н.С. СТУЛЁВА

Первый Московский государственный университет имени И.М. Сеченова,119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Хизроева Джамиля Хизриевна 1

Стулёва Надежда Сергеевна - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры акушерства и гинекологии медико-профилактического факультета, тел. +7-915-361-90-73, e-mail: 1

Михайлиди Ирина Архимедовна - аспирант кафедры акушерства и гинекологии медикопрофилактического факультета, тел. +7-903-798-08-97, e-mail: 1

Активированный протеин С (АРС), взаимодействуя с эндотелиальным рецептором протеина С (EPCR ), рецепторами, активируемыми протеазами (PAR ), рецептором аполипопротина Е2 и интегринами, оказывает различные эффекты на систему гемостаза (антикоагулянтный эффект) и иммунную систему организма (цитопротекторный эффект). Значение системы протеина С лучше всего демонстрируется протромботическими и воспалительными осложнениями, обусловленными дефицитом протеина С или нарушением его функции, которые в клинической практике проявляются в виде ишемического инсульта, воспалительного заболевания, атеросклероза, сосудистых осложнений и акушерских проблем. Изучение и понимание биологической функции АРС позволяет осуществлять контроль над свертыванием и воспалением и найти применение препаратам протеина С в качестве антикоагулянта и цитопротектора в клинической практике врача.

Ключевые слова : активированный протеин С, эндотелиальный рецептор протеина С, мутация фактора V Лейден, АРС-резистентность, тромбозы.

D .Kh . KHIZROEVA , I .A . MIKHAYLIDI , N .S . STULEVA

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 8-2 Trubetskaya St. , Moscow, Russian Federation 119991

Significance of protein C determination in obstetric practice

Khizroeva D.Kh. - Candidate of Medical Science, assistant of the Department of Obstetrics and Gynecology of Public Health Faculty, +7-915-361-90-73, e-mail:

Stuleva N.S. -Candidate of Medical Science, assistant of the Department of Obstetrics and Gynecology of Public Health Faculty, +7-915-361-90-73, e-mail: 1

Mikhaylidi I.A. - postgraduate student of the Department of Obstetrics and Gynecology of Public Health Faculty, +7-915-361-90-73, e-mail: 1

Activated protein C (APC), interacting with the endothelial protein C receptor (EPCR), receptors, activated by proteases (PAR), apolipoprotina E2 receptor and integrins, has various effects on the hemostatic system (anticoagulant effect) and the immune system (cytoprotective effect).Value of protein C is best demonstrated with prothrombotic and inflammatory complications caused by protein C deficiency or violation of its functions, which in clinical practice appear as ischemic stroke, inflammatory disease, atherosclerosis, vascular complications and obstetric problems. Learning and understanding the biological function of APC provides control over coagulation and inflammation and understanding the use of drugs with protein C as anticoagulant and cytoprotector in clinical practice of a physician.

Key words : activated protein С, endothelial protein C receptor, factor V Leiden mutation, АРС resistance, thromboses.

Внедрение в клиническую практику знаний по теоретической и клинической гемостазиологии существенно углубило наши представления о патогенезе различных осложнений в акушерской практике. Одним из важных компонентов системы гемостаза, регулирующих как гемостаз, так и иммунную систему человека в ответ на сосудистое или воспалительное повреждение, является система протеина С.

Система протеина С является естественной антикоагулянтной системой организма, обеспечивающей регуляцию свертывания, поддержание текучего состояния крови, предупреждение тромбоза, предотвращая, таким образом, сосудистое повреждение и стресс. Ключевой протеазой системы протеина С является активированный протеин С (АРС). Впервые протеин С был выделен в 1975 году доктором JohanStenflо, профессором кафедры клинической биохимии Лундского Университета (Швеция). До этого, в 1960 году, протеин С был открыт профессором Seegers, который и дал первое название протеину С - аутопротромбин IIа, или фактор свертывания XIV. Позже профессор Stenflo, изучая протромбиновый профиль, выделил методом хромотографии несколько субстанций и третьим по счету протеином (пик С) был новый витамин К-зависимый белок, который, соответственно, и был назван протеином С. Дальнейшее изучение протеина С Stenflo продолжил уже в лаборатории д-ра JohnSuttie в Мэдисоне (Висконсин), где работал вместе с постдокторантом CharlesEsmon, который конвертировал путем протеолиза трипсином (но не тромбином или фактором Xa) исходный неактивный протеин С в его активную форму. Дальнейшие попытки определить свойства нового белка и его роль в реакциях свертывания и агрегации тромбоцитов привели группу ученых из Сиэттла (Kisiel, Ericsson и Davie) к выводу, что трипсин-активированный протеин С не повышает формирования тромбина или агрегацию тромбоцитов, а, напротив, проявляет довольно ощутимый антикоагулянтный эффект .

Кроме антикоагулянтной активности, активированный протеин С оказывает цитопротективный и противовоспалительный эффекты на сосудистые эндотелиальные клетки, нейрональные клетки и различные клетки иммунной системы человека. Данные плейотропные эффекты системы протеина С на систему гемостаза и воспаления дали толчок новым исследованиям и привели к созданию рекомбинантного АРС, который нашел в применении в лечении тяжелого сепсиса (PROWESStrial).

Ген протеина С человека кодируется на 2-й хромосоме . Протеин C (гликопротеин с молекулярным весом 62000 дальтон, предшественник сериновой протеазы) синтезируется в виде единой полипептидной цепи, содержащей легкую цепь с молекулярным весом 21000 дальтон и тяжелую цепь с молекулярным весом 41000 дальтон, соединенных дисульфидной связью. По аминокислотной последовательности и структуре он высокогомологичен с тромбином и другими витамин К-зависимыми коагуляционными факторами - FVII, FIX, FX. Минимальная его концентрация в плазме крови здоровых людей составляет примерно 3 мг/мл, что эквивалентно 60 нмоль/л.

Протеин С синтезируется в печени и состоит из легкой и тяжелой цепей, молекулярная масса - 62000 Да. Физиологическая протеолитическая активация протеина С тромбином осуществляется на поверхности эндотелиальных клеток с участием трипсина и двух мембранных рецепторов, тромбомодулина и эндотелиального рецептора протеина С (EPCR). Тромбомодулин является высокоаффинным рецептором тромбина. Связанный с тромбомодулином тромбин в результате изменения конформации активного центра, меняет направленность своего действия. Тромбин приобретает повышенную чувствительность в отношении инактивации его антитромбином III и полностью теряет способность взаимодействовать с фибриногеном и активировать тромбоциты. В комплексе с тромбином тромбомодулин функционирует в качестве кофактора, ускоряя активацию протеина С. EPCR является ключевым рецептором протеина С в регулировании различных действий активированного протеина С (АРС). Связывание тромбина с тромбомодулином способствует активации протеина С. Эта реакция усиливается при локализации протеина С на поверхности эндотелия в соединении с EPCR (рис. 1). К примеру, активация протеина С комплексом тромбин-тромбомодулин в 1000 раз выше, чем активация просто тромбином в отсутствие ТМ, и она усиливается еще в 10-20 раз больше, если протеин С соединен со своим рецептором EPCR .

Рисунок 1.

Составные компоненты и эффекты системы протеина C. Три основные реакции протеина C, изображенные слева направо, это активация протеина C, антикоагулянтный путь протеина C и цитопротекторный путь протеина C. Слева - активация протеина C. Физиологическая активация протеина C (Pc) с помощью комплекса тромбина (Iia)-тромбомодулина (TM) на поверхности эндотелиальных клеток способствуется EPCR. Посередине - антикоагулянтный путь протеина C. APC оказывает свои антикоагулянтные действия методом протеолитической инактивации Fva and Fviiia, с помощью Ps на негативно заряженных фосфолипидных мембранах. Справа - цитопротекторный путь протеина C. АPC, соединенный с EPCR, расщепляет Par1 для инициирования внутриклеточных сигнальных путей с развитием цитопротекторного действия, которое включает противовоспалительную и антиапоптозную активность, нарушение профиля генной экспрессии и барьерно-протекторных действий.

Разъединение АРС с EPCR приводит к его высвобождению в плазму, где АРС инактивируется плазменными ингибиторами сериновых протеаз (серпинами), включающими ингибитор протеиназы а1 (a1-PI), ингибитор активатора плазминогена I (PAI-I), ингибитор протеина С (PCI) и др. PCI-опосредованное ингибирование АРС усиливается действием гепарина, тогда как формирование комплекса АРС-PAI-I ускоряется под влиянием витронектина. PCI может также подавлять связывание тромбина с ТМ. Обнаружение ингибитора протеина С PCI в участках повреждения мозга у больных склерозом привело ученых к изучению потенциальной эффективности АРС у мышей при склерозе и склерозоподобных заболеваниях.

Нейтрализация PAI-I в комплексе с АРС увеличивает фибринолитический потенциал. Терапевтическое введение высоких доз АРС ассоциируется со стимуляцией фибринолиза. Другой механизм усиления процесса фибринолиза активированным протеином С связан с антикоагулянтным эффектом АРС на формирование тромбина, что приводит к снижению активации TAFI (тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза) комплексом тромбин-ТМ.

Антикоагулянтная активность протеинаС

Как антикоагулянтный фермент АРС путем протеолитического протеолиза инактивирует факторы Va (FVa) и VIIIa (FVIIIa). Циркулирующий неактивный фактор V потенциально может проявлять прокоагулянтную или антикоагулянтную активность в зависимости от модификации про- или антикоагулянтными энзимами. Под воздействием тромбина образуется активный фактор V, обладающий прокоагулянтной активностью. После протеолитической инактивации активированным протеином С FVa превращается в неактивный фактор FVi. Расщепление FVa активированным протеином С начинается в сайте Arg 506, после чего FVa утрачивает способность взаимодействовать с FXa. Полная инактивация FVa происходит после расщепления в позиции Arg 306. Поскольку FVa усиливает выработку протромбинaзы в ~10 000 раз, то инактивация FVa с помощью APC эффективно снижает образование тромбина. Инактивация факторов FVa и FVIIIa на отрицательно заряженных фосфолипидных мембранах осуществляется с помощью кофакторов - протеина S и фактора V (Fvac). Важность протеина S подтверждается тем фактом, что недостаточность его в крови человека сопровождается тромбоэмболическими осложнениями. FVac образуется при активации фактора V активированным протеином С и обладает антикоагулянтной активностью. При этом образуется и кофактор активированного протеина С, участвующий вместе с протеином S в инактивации FVIIIa. Для возникновения АПС-кофакторной активности расщепление в сайте Arg 506 также принципиально важно. Фактор FVac под воздействием тромбина превращается в неактивный фактор FVi .

Соответственно FV, FVIIIa является важным кофактором для тиназного комплекса, который усиливает образование фактора Xa (FXa) приблизительно в 200 000 раз. Соответственно FVa, инактивация FVIIIa с помощью APC происходит после расщепления при Arg336 и Arg562. В отличие от FVa, расщепление FVIIIa на каком-либо месте приводит к полной потере активности. PS и FVас, но не FVa, обеспечивают усиливают APC-медиированную инактивацию FVIIIa.

Цитопротекторные свойства АРС обусловлены его способностью ингибировать экспрессию провоспалительных цитокинов, адгезивных молекул, предотвращать адгезию лейкоцитов. Функции активированного протеина C (АРС), как модулятора воспаления, реализуются через его рецепторы - эндотелиальный рецептор EPCR и рецептор, активируемый протеазой 1 (PAR1) на клетках эндотелия, моноцитах и других клетках. АРС ингибирует апоптоз и блокирует воспаление, изменяя профиль экспрессии генов в эндотелиальных клетках, снижает образование провоспалительных цитокинов активированными моноцитами, осуществляет защиту эндотелиальной барьерной функции . APC индуцирует протективные гены, активируя либо EPCR, либо каскад рецепторов EPCR-PAR1 . APC-медиированное цитопротекторное сигнализирование требует coвместной локализации PAR1 и EPCR в липидных скоплениях, обогащенных кавеолином-1, или кавеолах, возможно появляющихся в результате заполнения EPCR и инициирующихся в то время, когда APC, связанный с EPCR, активирует PAR1 . В дополнение ко многим исследованиям, свидетельствующим о том, что PAR1 и EPCR требуются для реализации протекторных эффектов APC на клетки, другие рецепторы, такие как сфингозин-1-фосфатный рецептор 1 (S1P1), рецептор 2 аполипопротеина E (ApoER2), гликопротеина Ib, CD11b/CD18 (αMβ2; Mac-1; CR3), PAR-3 и Tie2 также могут, как по одиночке, так и совместно, способствовать APC-инициированному сигнализированию на эндотелиальных и других клетках . Известно около 20 генов, экспрессию которых АРС повышает и 20 генов, экспрессию которых АРС подавляет. К первым относятся гены с противовоспалительной и антиапоптозной активностью, к последним - с провоспалительной и проапоптозной. АРС оказывает противовоспалительный эффект на эндотелиальные клетки и лейкоциты. Влияние на клетки эндотелия осуществляется путем ингибирования высвобождения провоспалительных медиаторов и снижения молекул адгезии сосудистого эндотелия. Это уменьшает адгезию лейкоцитов, инфильтрацию в тканях и ограничивает очаг разрушения подлежащих тканей. АРС поддерживает барьерную функцию эндотелия и снижает хемотаксис. АРС ингибирует высвобождение медиаторов воспалительного ответа в лейкоцитах, так же как и в эндотелиальных клетках, снижая ответ цитокинов и уменьшая системный воспалительный ответ, как это наблюдается при сепсисе. АРС оказывает нейпропротективный эффект. Антиапоптозное действие АРС было поводом для назначения препаратов рекомбинатного АРС в схему лечения сепсиса, так как снижение степени апопотоза коррелировало с более высокой выживаемостью септических пациентов. АРС защищает эндотелиальный барьер. Известно, что нарушение эндотелиального барьера и соответствующее повышение проницаемости эндотелия ассоциируется с отеками, гипотензией, воспалением, которые сопутствуют сепсису.

Значение системы протеина С лучше всего иллюстрируется протромботическими и провоспалительными осложнениями, обусловленными дефицитом протеина С или нарушением его функции при таких состояних как ишемический инсульт, воспалительные заболевания, атеросклероз, акушерские проблемы и др. Дефицит протеина С может быть генетическим или приобретенным.

Наследственный дефицит протеина С является аутосомно-доминантым и повышает риск тромбозов, степень которого зависит от гомозиготного или гетерозиготного носительства мутации. В настоящее время известно около 200 различных мутаций гена протеина С. Некоторые из них приводят к почти полной потере функции гена и развитию неонатальной фульминантной пурпуры, другие незначительно влияют на функцию белка и несколько повышают риск развития тромбофилии. Экспрессия мутаций гена протеина С, по-видимому, в значительной степени зависит от наличия других, в том числе наследственных, факторов риска, поскольку одни и те же мутации в различных семьях могут повышать риск тромбообразования в гетеро- или только гомозиготном состоянии. Гомозиготное носительство дефицита протеина С встречается достаточно редко и способствует развитию неонатальной фульминантной пурпуры или ДВС-синдрома в младенческом возрасте. С высоким уровнем смертности при отсутствии замещающей терапии протеином С. Гетерозиготные носители склонны к венозному тромбоэмболизму . Кроме того, у лиц с гетерозиготой варфарин может вызывать подобный феномен вследствие резкого снижения уровня протеина С. И, несмотря на антикоагулянтную функцию варфарина, в этой ситуации он провоцирует прокоагулянтный статус и способствует тромбообразованию в мелких сосудах кожи.

Различают два типа дефицита протеина С: I тип (истинный, количественный) встречается наиболее часто и характеризуется снижением уровня иммунологической и функциональной активности протеина С; тип II (дисфункциональный) - нормальная иммунологическая и сниженная функциональная активность протеина С.

Гетерозиготный дефицит протеина С встречается у 3,7% лиц с тромбозами глубоких вен нижних конечностей и 0,2-0,4% общей популяции. Дефицит протеина С повышает риск тромбообразования в 5-8 раз .

Протеин С - витамин К-зависимый гликопротеин. Дефицит протеина С ассоциируется с повышенным риском некроза кожи у пациентов, принимающих варфарин. Протеин С обладает коротким времени полужизни и составляет 6ч по сравнению с другими витамин К-зависимыми факторами. Риск варфаринового некроза кожи не зависит от характера основного заболевания и дозы непрямого коагулянта. Это осложнение чаще всего обусловлено дефицитом протеина С. Поскольку Т1/2 протеина С значительно короче по сравнению с Т1/2 факторов свертывания, а варфарин подавляет синтез всех витамин-К-зависимых факторов, то у лиц с наследственным дефицитом протеина С варфарин вызывает прежде всего резкое снижение концентрации протеина С. Это приводит к временному повышению свертываемости крови и тромбоз сосудов кожи с последующим инфарктом кожи.

Как описывалось выше, протеин С активируется тромбином, связанный с тромбомодулином на поверхности эндотелиальных клеток. Рецептор эндотелиального протеина С/активированного протеина С (EPCR) представляет собой гликопротеин, экспрессируемый на мембране эндотелиальных клеток сосудов, который специфически и с высоким сродством связывается с протеином С и АРС. Для функционирования EPCR должен быть связан с фосфолипидной мембраной, которая стабилизирует его трехмерную структуру. Связывание протеина С с EPCR усиливает его активацию под действием комплекса тромбин-ТМ. EPCR обнаруживается, в основном, на мембране крупных сосудов. Кроме того, он интенсивно экпрессируется синцитиотрофобластом, что предупреждает развитие тромбоза и играет определенную роль в сохранении беременности. В плазме некоторых людей присутствует растворимая форма EPCR (sEPCR), который отличается от обычного EPCR отсутствием трансмембранного домена и цитоплазматического «хвоста». sEPCR связывает протеин С и АРС с таким же сродством, как и EPCR, однако это связывание с АРС подавляет антикоагулянтную активность протеина С из-за блокирования соединения АРС с фосфолипидной поверхностью, что делает АРС неспособным инактивировать фактор Va. В отличие от мембран-ассоциированной формы EPCR, протеин С, связанный sEPCR не приводит к усилению активации протиена С комплексом тромбин-ТМ. sEPCR-зависимая активация протеина С, напротив, является тромбогенной. Нарушение функции EPCR может быть обусловлено наличием мутаций/полиморфизмов, приводящих к снижению количества мембранного EPCR (такого рода точечные мутации встречаются очень редко) и мутаций/полиморфизмов в гене EPCR, приводящих к повышенному содержанию в крови растворимой формы EPCR (sEPCR). Известно около 13 полиморфизмов в гене EPCR. Полиморфизм в гене 6936 A/G в гене EPCR ассоциируется с повышенным риском тромбозов, инфаркта миокаррда, невынашиванием беременности. Также было отмечено, что полиморфизм гена может играть роль в развитии малярийной инфекции и ассоциируется с большим риском онкологических заболеваний .

Резистентность к активированному протеину С (АРС-R) означает неспособность протеина С расщеплять и инактивировать факторы Va и/или VIIIa. Разнообразные пусковые факторы могут быть причиной резистентности к протеину С, которая может быть наследственно обусловленной или приобретенной. Наиболее распространенным примером генетически обусловленной АРС-R является мутация фактора V Лейден.

Впервые резистентность к активированному протеину С как причина наследственной тромбофилии была описана в трех разных семьях шведским ученым Dahlbaecketal. в 1993 году . Следствием этой мутации являются нарушения в функционировании системы протеина С, представляющей важнейший естественный антикоагулянтный путь. Как было сказано выше, в условиях нормы АРС ингибирует коагуляцию путем расщепления ограниченного числа пептидных связей как в интактном, так и в активированном факторе V (FV/FVa), а также в VIII факторе (FVIII/FVIIIа). АРС-зависимое расщепление FVa стимулируется протеином S и протеолитически модифицированного FV под действием АРС. Таким образом, в норме фактор V потенциально опосредует две противоположные функции: а) прокоагулянтную - после кливажа тромбином или фактором Ха (FХa) и б) антикоагулянтную - после кливажа активированным протеином С (АРС). Протромботический эффект APC-R при FV-мутации Лейдена имеет по меньшей мере 2 объяснения:

Нарушение деградации FVa под действием АРС, в то время как прокоагулянтный эффект мутировавшего FVa сохраняется.
Нарушение в процессе деградации FVIIIa, поскольку нормальный кливаж FV в области Arg506 необходим для осуществления синергичной APC-кофакторной активности FV наряду с протеином S в деградации фактора VIIIa.

Наряду с описанными выше эффектами фактора VLeiden весьма значимы и эффекты этой мутации на фибринолиз. В настоящее время хорошо известны профибринолитические свойства АРС. Нарушение профибринолитического ответа на АРС у пациентов FVLeiden является TAFI-зависимым. Этот феномен представляет один из немаловажных механизмов протромботической тенденции у пациентов с мутацией FVLeiden.

Вскоре после описания АРС-резистентность стала довольно часто (20-60%) обнаруживаться среди пациентов с тромбозами в западном мире. Наоборот, не было слышно о ней в Азии. Причина оказалась в том, что аллель FV:Q506, вызывающий АРС-резистентность, обнаруживался лишь в европейских родословных (белая раса), и отсутствует у местного населения Азии, Африки, Америки и Австралии. Предполагают, что единичная мутация гена, кодирующего фактор V, произошла около 30 000 лет назад, т.е. после миграции населения из Африки 100 000 лет назад и сегрегации азиатов от европейцев. Это объясняет частоту мутации в Европе, и отсутствие ее в Японии и Китае, а также среди местного населения Азии, Африки и Америки .

Риск тромбозов при АРС-резистентности чрезвычайно велик. Среди больных с этим осложнением лейденская мутация составляет 25-40%. При этой мутации риск тромбозов почти в 8 раз выше, чем в отсутствие мутации, а при гомозиготном носительстве почти в 90 раз.

По данным A. Gerhardtetal. (2000), лейденская мутация наблюдалась у 44% женщин из 119 с тромбоэмболическими осложнениями при беременности .

По данным J. Meinardietal. (1999), среди 228 носителей мутации риск прерывания в 2 раза выше, чем в группе женщин с невынашиванием, но не носителей мутации, 80% потерь беременности у носителей мутации были в I триместре и до 16 недель .

В недавнем исследовании Bare S.N. etal. (2000) сообщили, что риск выкидыша и бесплодия в 2,5 раза выше для носителей мутация VLeiden.

Антифосфолипидные антитела (АФА) обладают способностью ингибировать систему протеина С несколькими путями (рис.):

1) ингибируют формирование тромбина, активатора протеина С (тромбиновый парадокс);

2) ингибируют активацию протеина С через влияние на тромбомодулин (антитела к тромбомодулину);

3) ингибируют АРС активность (приобретенная резистентность АРС), что может достигаться: а) через ингибицию сборки протеинов комплекса протеина С на анионных поверхностях фосфолипидных матриц; б) через прямую ингибицию АРС активности; в) через ингибицию кофакторов Va и VIIIa;

4) антитела влияют на уровни протеина С и/или протеина S (приобретенный дефицит).

Так называемый тромбиновый парадокс связан с тем, что тромбин обладает и анти-, и протромботическими свойствами в системе гемостаза. При низких концентрациях тромбина проявляется преимущественно активация естественного антикоагулянта - протеина С. В этот момент тромбин - антитромботический агент. Когда формируется больше тромбина, фибриноген превращается в фибрин, а FVа и FVIIIa активируются: тромбин проявляет протромботические свойства. АФА ингибируют низкие уровни формирования тромбина, которые наблюдаются в норме, и снижает уровни циркулирующего активированного протеина С (АРС). После повреждения сосудистой стенки уровня циркулирующего АРС становится недостаточно для предупреждения неконтролируемого образования тромба, и гемостатический баланс смещается в протромботическую сторону.

Рисунок 2.

Влияние антифосфолипидных антител на систему протеина С. Антитела к протромбину и b2-гликопротеину Iнарушают формирование протромбиназного комплекса. Это механизм лежит в основе феномена волчаночного антикоагулянта. Антитифосфолипидные антитела обуславливают формирование резистентности к активированному протеину С за счет нескольких механизмов: нарушение образования тромбина - активатора протеина С (тромбиновый парадокс), инактивация протеинов С и S, нарушении функции тромбомодулина (антитела к тромбомодулину), нарушение сборки АРС на анионной фосфолипидной поверхности.

Состояния, сопровождающиеся низким уровнем протеина С (приобретенный дефицит), включают:

Терапию варфарином;

Заболевания печени (цирроз печени);

Дефицит витамина К;

Свежий тромбоз;

Длительную антибиотикотерапию с недостаточным приемом пищи;

Метастазирующие опухоли;

ДВС-синдром;

Тяжелую бактериальную инфекцию в молодом возрасте.

У взрослых приобретенный дефицит протеина С не всегда ведет к тромбозу, потому что в этих условиях уровень других факторов свертывания также часто понижен. У детей приобретенный дефицит протеина С чаще всего обусловлен бактериальной инфекцией, особенно менингеальной и в таких условиях риск тромбозов достаточно высок.

Уровень протеина С всегда низкий у пациентов, принимающих варфарин. Нет необходимости в определении уровня протеина С у таких пациентов. При необходимости контроля необходимо отменить варфарин за 14 дней до проведения анализа. При сохранении риска тромбоза на время отмены варфарина следует назначить препараты низкомолекулярного гепарина. Так как протеин С вырабатывается в печени, то пациенты с заболеваниями печени также имеют низкий уровень протеина С.

Концентрация протеина С в плазме здоровых новорожденных составляет около 40 МЕ/дл. В крови здоровых взрослых людей уровень протеина С в норме составляет 65-135 МЕ/дл.

Нам представляется, что оценка системы протеина С имеет важное диагностическое и прогностическое значение для множества патологических состояний в акушерско-гинекологической практике. В частности при циркуляции антифосфолипидных антител и в условиях АФС может иметь место образование антител ко всем компонентам сборки системы протеина С (тромбомодулину, протеину S, протеину С); системы протеина С практически всегда повреждается у женщин с гомозиготной или гетерозиготной формой мутации фактора V Лейден, при наследственной и приобретенной форме недостаточности протеина С. Речь идет о таких заболеваниях и осложнениях в акушерстве, как преэклампсия/эклампсия, ПОНРП, привычное невынашивание, преждевременные роды, многоплодная беременность, синдром потери плода, тромбозы, тромбоэмболии, СЗРП, печеночная недостаточность, синдром гиперстимуляции яичников, неудачи ЭКО, септические состояния, септический шок и пр.

К сожалению, до настоящего времени в клинической и акушерской практике далеко не всегда скрининговыми методами оценивается система протеина С, следствием чего является недостаточная информация о функциональном состоянии гемостаза.

Определение протеина С может быть выполнено различными методами:

1) ИФА-определение уровня протеина С (нет оценки функциональной активности).

2) Определение уровня антител к протеину С.

3) Определение функциональной активности протеина С амидолитическими или коагулометрическими методами (глобал тест). Оба функциональных теста основаны на применении активатора протеина С из яда щитомордника Agkistrodon contorix. Под действием активатора протеин С активируется и в присутствии своего кофактора S вызывает протеолиз факторов Va и VIIIа. Поэтому после добавления активатора к нормальной плазме происходит удлинение времени свертывания. При недостаточном количестве протеина С, протеина S или при APC-R удлинение выражено в меньшей степени. На результаты влияют состояния, сопровождающиеся витамин-К недостаточностью (прием непрямых антикоагулянтов, обтурационная желтуха и другие заболевания печени). При недостатке витамина К некарбоксилированные молекулы протеина С теряют антикоагулянтную активность, определяемую коагулометрическим методом, однако сохраняют амидолитическую и антигенную активность.

В клинической практике в случаях недостаточности протеина С появилась возможность заместительной терапии препаратами протеина С (сепротин, дротрекогин альфа), которые обладают как антикоагулянтными и профибринолитическими эффектами (влияние на систему гемостаза), так и противовоспалительными и антиапоптозными эффектами (цитопротективное действие). Однако незначительный опыт свидетельствует о крайне важной необходимости контроля за гемостазом при проведении терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Weiler H. Multiple receptor-mediated functions of activated protein C. // Hamostaseologie. - 2011. - Vol. 31, № 3 - P. 185-195.

2. Patracchini P., Aiello V., Palazzi P., Calzolari E., Bernardi F. Sublocalization of the human protein C gene on chromosome 2q13-14 // Hum.Genet. - 1989. - Vol. 81. - P. 191-192.

3. Гусина А.А., Гусина Н.Б. Генетические дефекты про- и антикоагулянтных белков как факторы риска венозных тромбозов // Медицинские новости. - 2006. - № 9. - С. 10-14.

4. Горбачева Л.Р. Нейропротективное действие клинических протеиназ гемостаза: автореф. дис. … д-ра биол. наук. - Москва, 2008. - 49 с.

5. Spek C.A., Reitsma P.H. Genetic risk factors for venous thrombosis // Molecular Genetics and Metabolism. - 2000. - Vol. 71, № 1-2. - P. 51-61.

6. Larsen T.B., Lassen J.F., Brandslund I., Byriel L., Petersen G.B., Nørgaard-Pedersen B. The Arg506Gln mutation (FV Leiden) among a cohort of 4188 unselected Danish newborns // Thrombosis Research. - 1998. - Vol. 89, № 5. - P. 211-215.

7. Voetsch B., Loscalzo J. Genetic determinants of arterial thrombosis // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology - 2004. - Vol. 24, № 2. - P. 216-229.

8. Mosnier L.O., Zlokovic B.V., Griffin J.H. The cytoprotective protein C pathway // Blood. - 2007 Apr 15. - Vol. 109, № 8. - Р. 3161-72.

9. Griffin J.H., Mosnier L.O., Zlokovic B.V. Protein C anticoagulant and cytoprotective pathways // International Journal of Hematology. - 2012 Apr. - Vol. 95, № 4. - Р. 333-45. doi: 10.1007/s12185-012-1059-0. Epub 2012 Apr 5.

10. Chen X.D., Tian L., Li M., Jin W., Zhang H.-K., Zheng C.-F. Relationship between endothelial cell protein C receptor gene 6936A/G polymorphisms and deep venous thrombosis // Chinese Medical Journal. - 2011 Jan. - Vol. 124, № 1. - Р. 72-75.

11. Saposnik B., Reny J.-L., Gaussem P., Emmerich J., Aiach M., Gandrille S. A haplotype of the EPCR gene is associated with increased plasma levels of sEPCR and is a candidate risk factor for thrombosis // Blood February 15. - 2004. - Vol. 103, № 4. - Р. 1311-1318.

12. Макацария А.Д., Бицадзе В.О. Тромбофилии и противотромботическая терапия в акушерской практике. - М.: Триада-Х, 2003.

13. Dahlbäck B., Carlsson M., Svensson P.J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1993 February 1. - Vol. 90, № 3. - Р. 1004-1008.

При постановке женщины на учет и после 30 недели беременности очень важно проводить мониторирование основных показателей гемостаза. Изменение этих показателей в период беременности носит компенсаторно-приспособительный характер и направлено на формирование нормального фето-плацентарного комплекса и на снижение кровопотери при родах. Перечислим эти изменения:

Таким образом, при беременности в организме женщины создаются определенные условия для развития синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром): это выражается:

Перечисленные выше особенности гемостаза при беременности помимо изменений компенсаторно-приспособительного (позитивного) характера, могут приводить и к негативным последствиям – к развитию тромбозов (частота развития тромбофилий - состояний, при которых резко увеличивается риск развития тромбозов и тромбоэмболии - при беременности может достигать 30%) и это, как было указано выше, обуславливает высокую актуальность (значимость) мониторирования основных показателей гемостаза в период беременности.

На сегодняшний день существует возможность определять достаточно обширный спектр показателей гемостаза как тканевого, так и плазменного звена. Безусловно, проводить определение всех показателей – не рационально как с клинической, так и с экономической точки зрения. Рядом авторов рекомендуется поэтапный клинико-диагностический алгоритм выявления тромбофилических состояний у беременных:

читать

В настоящее время известно и хорошо изучено шесть основных генетически обусловленных форм тромбофилий:

Резистентность к активированному протеину С (мутация V фактора). Известно, что из шести выше перечисленных форм тромбофилий наиболее частым фактором риска в европейской популяции является резистентность к активированному протеину С (мутация V фактора - у гетерозигот риск развития тромбозов возрастает в 5 - 10 раз, а у гомозигот в 50 - 100 раз). Частота встречаемости мутации V фактора у пациентов с тромбофилиями достигает 40%. Диагностика резистентности активированного протеина С (аРС)может проводиться различными методами, но самым удобным скрининговым методом является клотинговый метод на коагулометре с использованием диагностических наборов.

Дефицит антитромбина III (АТ-III). АТ-III – естественный антикоагулянт. На его долю приходится 75 - 80% всего коагулянтного потенциала крови. Синтезируется в печени и в эндотелиальных клетках. Частота встречаемости у пациентов с тромбофилиями - 5%. Снижение активности АТ-III менее 60% может указывать на его наследственный дефицит, однако при диагностике необходимо исключить заболевания печени, т. к. нарушения ее функции наряду с септическими заболеваниями и острыми тромбозами являются главными причинами приобретенного и временного дефицита. Также при диагностике AT-III важно использовать хромогенный метод, основанный на способности плазмы инактивировать фактор Х(а).

Дефицит протеина С. Протеин С (PC) – естественный антикоагулянт, витамин К-зависимый гликопротеин, синтезируется в печени в неактивной форме. Частота встречаемости у пациентов с тромбофилиями - 4%. PC переходит в активную форму (АРС) путем взаимодействия с комплексом тромбин-тромбомодулин. Дефицит PC ведет к снижению концентрации aРС, что приводит к замедлению инактивации факторов Va и VIII(a). Различают два типа дефицитных состояний: тип I - количественный дефицит протеина С (снижен синтез или снижено время жизни белка) и тип II - нарушение структуры белка. Описаны нарушения структуры белка, приводящие к нарушению взаимодействия с фосфолипидами, тромбомодулином, факторами V/VIII и другими веществами. Протеин С можно определять различными методами: хромогенными, клоттинговыми и иммуно-химическими. Оптимальные для клинической интерпретации результаты получаются при использовании хромогенного метода.

Дефицит протеина S. Протеин S (PS) – неэнзиматический кофактор протеина С, участвует в инактивации V и VIII факторов, обладает своей, независимой от протеина С, антикоагулянтной активностью. PS – витамин К-зависимый гликопротеин, синтезируется в печени. Существует в двух формах: свободный протеин S и связанный с С4 (протеин комплимента). В норме 60 - 70% находится в связанном виде. Уровень связывания PS с С4 определяет его активность, т.к. активна только свободная форма. В норме уровень PS 80 - 120%, при беременности его уровень падает и составляет 60 - 80%. Частота встречаемости наследственного дефицита у пациентов с тромбофлиями - 4%. Наиболее точно определение концентрации свободного PS осуществляют
иммунологическим методом.

Мутация гена протромбина G 20210 А. Вследствие данной мутации увеличивается синтез протромбина. Частота встречаемости среди пациентов с тромбофилией - 1%. Диагностика - молекулярно-генетический метод.

Гипергомоцистеинемия (ГГЦ) определяется у пациентов с тромбофилией с частотой 13 - 27%. ГГЦ может быть следствием дефекта фермента или дефицита фолиевой кислоты и витаминов В12 и В6. Молекулярные механизмы, которые вызывают тромбогенные воздействия, не идентифицированы до сих пор. Определение гомоцистеина проводится методом ИФА (иммуно-ферментный анализ).

Повышенная активность VIII фактора. Постоянное повышение активности VIII фактора более 150% без одновременного повышения концентрации С-реактивного белка как показателя реакции острой фазы, отмечается примерно у 20% пациентов с тромбофилией. Наследственная причина повышения уровня VIII фактора в плазме до сих пор не идентифицирована. Определение активности VIII фактора наиболее целесообразно проводить с помощью хромогенного метода.

Описание:

Протеин С - естественный антикоагулянт, зависимый от витамина К гликопротеин, синтезируется в печени в неактивной форме.

Активированный протеин С - сериновая протеаза, функция которой направлена на инактивацию факторов Va и VIIIa, важный регулятор активности тромбина на поверхности эндотелия. Протеин С активируется при взаимодействии тромбина с тромбомодулином. Эта связь ускоряет образование тромбина в форму активированного протеина С. Активность протеина С усиливается его кофактором - протеином S. Активированный протеин С протеолитически инактивирует факторы Va и VIIIa в присутствии протеина S, фосфолипида (поверхность эндотелия) и кальция, ингибируя дальнейшую активацию тромбина.

В норме уровень протеина С составляет 65–145%. При беременности он несколько повышается и составляет 70–150%, еще больше он повышается в послеродовом периоде.

Симптомы:

Привычная потеря беременности, мертворождения, плодовые потери (до 27,9%);
- венозные тромбозы и тромбоэмболии в возрасте 20–30 лет любых локализаций;
- некрозы кожи, подкожной клетчатки (особенно при лечении непрямыми антикоагулянтами);
- повышение риска тромбозов при применении оральных контрацептивов;
- практическое отсутствие артериальных тромбозов.

Причины возникновения:

Врожденный дефицит протеина С обусловлен мутацией гена. Ген протеина С расположен на хромосоме 2. Известно более 150 мутаций гена. Очень часто дефицит протеина С сочетается с мутацией фактора V.

Дефицит протеина С встречают несколько чаще, чем дефицит антитромбина III, среди больных с тромбозами и тромбоэмболиями эту патологию отмечают примерно у 10% больных.

Дефицит протеина С наследуется аутосомно-доминантно. Уровень протеина С у гетерозиготных носителей равен 30–60% от нормы, гомозиготные практически не имеют протеина С и погибают внутриутробно или сразу после рождения.

Наследственный дефицит протеина С может быть 2 типов:

* I тип - снижение количества протеина С;
* II тип - снижение активности протеина С при его нормальном уровне.

Лечение:

Для лечения назначают:

Больные с гетерозиготным дефицитом протеина С при острых тромбозах должны получать гепарин, а позднее - переходить на непрямые антикоагулянты. При этом, однако, следует помнить, что непрямые антикоагулянты могут снизить уровень не только фактора II , фактора VII , фактора IX и фактора X , но и протеина С, что сведет на нет его антитромботическое действие. Учитывая при этом тот факт, что дефицит протеина С предрасполагает к развитию варфариновых некрозов кожи.

При гомозиготном дефиците протеина С для профилактики тромбозов и

Протеин S

Протеин S – один из показателей противосвертывающей системы, обуславливающий жидкое состояние крови. Исследование концентрации белка входит в гемостазиограмму. Данный маркер имеет самостоятельное прогностическое значение, но иногда определяется вместе с активностью протеина С. Тест назначают при патологии синтеза протеина S или для подтверждения нарушений других компонентов гемостаза. Для исследования используется плазма, которую выделяют из венозной крови. Определение концентрации протеина S чаще всего проводится с помощью коагуляционного или иммунохимического метода. У здорового взрослого человека показатели протеина S в крови колеблются от 20 до 25 мг/л. Срок выполнения анализа составляет один рабочий день (в некоторых лабораториях 7-10 суток из-за загруженности).

Протеин S является естественным антикоагулянтом и кофактором протеина C (белки усиливают профибринолитическое действие друг друга). Данный показатель считается витамин К-зависимым белком, который продуцируется в гепатоцитах. Протеин S может находиться в плазме в двух формах: связанной и свободной. Биологически активна только свободная фракция, из-за этого ее определение более информативно. Концентрация протеина S зависит от возраста, пола и гормонального фона. Дефицит свободной формы протеина S бывает врожденным и приобретенным. Врожденный дефицит делится на 3 подтипа. Первый подтип приводит к понижению концентрации общей и свободной фракции протеина S и уменьшению его функциональной активности, второй подтип способствует понижению функциональной активности при нормальном количестве общего и свободного протеина S в крови, третий подтип характеризуется уменьшением концентрации только свободной формы.

Исследование довольно часто применяется в хирургической практике. Обычно перед оперативным вмешательством хирург назначает анализы на определение всех компонентов системы гемостаза, в группу исследований включают и тест на активность протеина S. Противосвертывающий белок S тесно связан с процессом тромбообразования. Антикоагулянт ограничивает запуск свертывающей системы и не допускает преждевременного формирования тромбов. Также свободная форма протеина S способствует активности кофактора (без него концентрация протеина С будет минимальной).

Показания и противопоказания

Данный анализ назначается только при наличии прямых показаний (при перенесенном тромбозе в анамнезе). Тест иногда проводится беременным (при наличии тромбофилии), но исследование не входит в программу скрининговых обследований. Врачи-хирурги направляют на анализ при назначении непрямых антикоагулянтов после протезирования суставов и операций на сердце или сосудах. Иногда показанием к тесту становится необходимость подтвердить результаты исследований, касающихся процесса свертывания и разжижения крови (например, при определении уровня фибриногена, АЧТВ, протеина C, протромбинового времени или антитромбина III). Гемостазиолог может назначить анализ при генетических исследованиях, осуществляемых после выявления врожденного дефицита протеина S у близкого родственника больного. Противопоказаниями к проведению теста считаются психические отклонения, при которых сложно выполнить забор крови, и возникновение острого тромботического эпизода.

Подготовка к исследованию и забор биоматериала

Исследованию подвергается плазма, выделенная из крови. Если необходима транспортировка биоматериала, жидкость помещают в цитратную пробирку и перевозят в стерильном контейнере. Перед забором крови пациенту желательно воздержаться от приема пищи, употребления алкогольных и газированных напитков. В течение 2-3 часов нужно избегать эмоциональных перегрузок и физической активности. За полчаса рекомендуется не курить. Можно пить простую негазированную воду. Если врач прописал больному прием каких-либо лекарственных препаратов, важно сделать перерыв в лечении и только через 25-30 дней провести анализ. Другие методы обследования желательно производить после забора биоматериала. Анализ предпочтительно сдавать в утреннее время, поскольку существуют суточные ритмы активности показателя (с 7.00 до 11.00 колебания большинства гормональных и биохимических показателей совсем незначительны).

Чаще всего для определения протеина S используют коагуляционный и иммунохимический метод, каждая методика имеет свои достоинства и недостатки. Коагуляционный метод включает использование тест-систем. Специфичность методики относительна, потому что фактор Лейдена, повышенный уровень фактора VIII и волчаночный антикоагулянт могут сильно повлиять на результаты анализа. Обычно с вышеперечисленными факторами проводится дифференциальная диагностика для определения уровня протеина S. Коагуляционная проба не стандартизирована, поэтому в некоторых лабораториях применяют иммунохимический метод. В этом случае используются современные наборы, которые помогают выявить свободную форму протеина S без предварительной обработки. Но методика тоже имеет свои недостатки – тест определяет и неактивные формы протеина S, иногда возникающие в плазме. Срок проведения анализа – от 1 до 10 суток в зависимости от загрузки лаборатории.

Показатели нормы

Активность антикоагулянта измеряется в %:

общий – 60-140;
свободный – 65-115.

Концентрация протеина S измеряется в мг/л, общая колеблется в диапазоне от 20 до 25, из которых около 40% составляет свободная фракция. У новорожденных и грудничков (до 12 месяцев) показатели активности белка составляют от 40% до 90%. Концентрация антикоагулянта у мужчин немного выше, чем у женщин. В каждой лаборатории применяются различные реактивы и оборудование, поэтому референсные нормы немного отличаются.

Повышение уровня

Основной причиной повышения протеина S в крови является наследственная патология системы гемостаза. Причины повышения протеина S в крови не имеют важного клинического значения, так как данные отклонения не вызывают серьезных проблем со здоровьем.

Снижение уровня

Пониженная активность протеина S может быть врожденной и приобретенной. Врожденный дефицит белка проявляется с рождения и характеризуется развитием тромбофилии. Одной из причин снижения протеина S в крови является нарушенный синтез витамина K в печени при гепатите, печеночной недостаточности или циррозе. Низкая активность протеина S наблюдается при инфекционных патологиях (сепсисе или септицемии), болезнях почек, СПИДе, злокачественных новообразованиях и ДВС-синдроме.

Причиной снижения протеина S в крови могут быть мутации генов. Врожденные нарушения особенно опасны во время беременности. Исследования показывают, что данная патология часто приводит к мертворождению плода или выкидышу (около 15%). У женщин концентрация белка немного понижается во время приема эстрогенов (оральных контрацептивов), которые увеличивают вероятность развития тромбоза вен.

Лечение отклонений от показателей нормы

Исследование играет важную роль в клинической практике, особенно при определении генетических патологий противосвертывающей системы или перед плановыми хирургическими вмешательствами. С результатами анализа нужно обратиться к одному из следующих специалистов: гемостазиологу, терапевту, хирургу, акушеру или флебологу. При наличии острых тромботических осложнений врач назначает гепарин натрия или низкомолекулярные препараты. Во время беременности может применяться варфарин (особенно при наличии тромбофилии).

Скорректировать незначительные отклонения от нормы можно с помощью диеты, нормализации питьевого режима и активных тренировок. При отсутствии патологии, правильной подготовке к анализу и соблюдении всех рекомендаций врача результаты теста будут достоверными и приближенными к референсным показателям.

Метод определения

Автоматический анализатор параметров свёртывающей системы ACL TOP, метод - кинетический колориметрический.

Исследуемый материал Плазма (цитрат)

Один из важнейших естественных ингибиторов свёртывания.

Протеин С - один из наиболее важных физиологических ингибиторов свёртывания. В активной форме он расщепляет и инактивирует факторы свёртывания VIIIa и Va (но не фактор V Лейдена). Протеин C проявляет антикоагулянтную активность, косвенно активирует фибринолиз, ограничивает размеры тромба. In vivo протеин С активируется тромбином, многократно ускоренно - комплексом тромбина и тромбомодулина (белок на поверхности эндотелиальных клеток).

Антикоагулянтную активность протеина C усиливает его кофактор - . Протеин C синтезируется в печени, является витамин К - зависимым белком, поэтому активность его зависит также от дефицита витамина K и терапии оральными антикоагулянтами. Уровень протеина С у новорождённых и детей младшего возраста физиологически ниже, чем у взрослых вследствие незрелости печени. Врождённый дефицит протеина С связан со склонностью к тяжёлым тромботическим нарушениям. Среди врождённых видов дефицита физиологических антикоагулянтов, таких как дефицит антитромбина III, дефицит протеина C, дефицит протеина S - дефицит протеина C наиболее распространён (0,2-0,4% популяции). Гомозиготные состояния проявляются в раннем детстве фульминантной пурпурой новорождённых и часто фатальны, уровень протеина C у таких новорождённых находится на неопределяемом уровне.

Пациенты с дефицитом протеина С обычно являются гетерозиготами, у которых тромбозы не проявляются ранее второй-третьей декады жизни. Среди них около 5% могут также иметь мутацию фактора V (фактор V Лейдена) в гетерозиготном состоянии. Присутствие этой мутации считают фактором риска развития ранней тромботической патологии (см. генетические исследования, тромбофилии, тест № 7171). Дефицит протеина C связан с повышенным риском осложнений беременности (тромбоз глубоких вен, преэклампсия, внутриутробная задержка развития плода и повторные выкидыши). Отмечается увеличенный риск развития варфарин-индуцированного некроза кожи. Усугубляется действие факторов риска, связанных с вредными привычками.

Врождённые дефицитные состояния могут быть диагностированы, когда причины приобретённого дефицита протеина C исключены. Исследование протеина C с данной целью не рекомендовано проводить во время острых заболеваний/острых тромботических эпизодов, вследствие потребления протеина С, а также у пациентов, получающих терапию оральными антикоагулянтами (варфарин понижает уровень протеина C).

Рекомендованы повторные тестирования протеина C после прекращения терапии оральными коагулянтами (лучше через месяц после окончания терапии), в корреляции с обследованием членов семьи. У гетерозигот по дефициту протеина C значения частично перекрещиваются с нормальным референсным диапазоном. Нарушение активации протеина С возникает при патологических состояниях, связанных с наличием таких факторов как гипоксия, эндотоксин, интерлейкин-1, фактор некроза опухоли альфа, высокий уровень гомоцистеина (все они ускоряют свёртывание, индуцируя экспрессию тканевого фактора и подавляя транскрипцию тромбомодулина эндотелиальными клетками).

Показана информативность тестирования протеина С в прогностических целях в септических состояниях (характеризуются повышенным потреблением, разрушением и нарушением синтеза протеина С). Уровень активности протеина С < 40%, а также снижение более чем на 10% за 1 день при сепсисе коррелирует с неблагоприятным прогнозом.

Литература

Shorr A.F. R92 Protein C concentrations in severe sepsis: an early directional change in plasma levels predicts outcome Critical Care 2006,10: R92 http://ccforum.com/content/10/3/R9.

Методические материалы фирмы-производителя реагентов.